HPLC

Es una cromatografía en columna cuyo objetivo es separar los componentes de una mezcla para cuantificarlos, o bien obtenerlos puros. La muestra debe estar solubilizada. La fase móvil es un solvente o mezcla de solventes, y la fase estacionaria – empacada dentro de una columna de acero – es un sólido fino que recubre pequeñas partículas de tamaño uniforme (de usualmente, 2 a 10 µm). Por acción de una bomba, se hace pasar una mezcla de compuestos o analitos en un sistema disolvente comúnmente conocido como fase móvil. La fase móvil pasa  a través de una columna cromatográfica, que contiene la fase estacionaria a un flujo especificado. La separación de los compuestos ocurre en base a la interacción de éstos con la fase móvil y la fase estacionaria.

Fase normal: Los compuestos se separan en función de su polaridad. La fase estacionaria es polar, y la fase móvil, apolar. Se utiliza cuando el analito es polar, y hoy en día es mucho menos utilizada que la cromatografía en fase reversa.

Fase reversa: Es tan difundida, que suele denominarse simplemente HPLC. La fase estacionaria es apolar (generalmente sílica modificada), y la fase móvil es polar (agua, metanol, acetonitrilo, etc). Las moléculas polares eluyen más rápidamente. Esta técnica se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas entre los analitos y la sílica modificada. La gran mayoría de los métodos de HPLC utilizan esta técnica.

Los detectores más comunes son UV – Visible, Arreglo de diodos, y de Fluorescencia. También se puede acoplar a un espectrómetro de masas (HPLC-MS).

A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.

Esta técnica presenta distintas propiedades, como:

• Es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.
• Ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.

HPLC de escala Preparativa y Semipreparativa

Cuando se quieren purificar pequeñas cantidades de componentes (menos de 0,5 gramos), se utiliza  un HPLC de Escala Semipreparativa, lo que requiere un equipo distinto al utilizado para HPLC de escala analítica (mayores flujos de fase móvil, distintas columnas, mayores volúmenes de solventes). Para purificar cantidades de componentes mayores a los 0,5 gramos (hasta usualmente los 2 gramos), se utiliza un HPLC de Escala Preparativa, en la que el flujo de fase móvil suele ir de los 50 a los 1000 ml/min.

UHPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography

Es una técnica con la que se logra mayor velocidad de análisis y mayor resolución que con un HPLC tradicional. El tamaño de las  partículas es usualmente de 2 µm o menos, y se requiere de una bomba distinta a la del HPLC, ya que la presión de trabajo puede llegar a más de 1000 bar y el flujo, a 5 ml/min.

El equipo Waters, permite la separación, cuantificación e identificación de constituyentes de una mezcla mediante un inyector manual y un detector de arreglo de fotodiodos (PDA). El detector PDA 2998 de Waters permite una detección óptica avanzada y ofrece una detección y cuantificación sin precedentes de impurezas traza conjuntamente con la capacidad de realizar análisis espectrales. Es el detector ideal para cualquier aplicación del laboratorio, desde la identificación de compuestos hasta el desarrollo de métodos. A la hora de efectuar análisis de rutina, el detector PDA 2998 es fiable y fácil de usar. Un control mejorado del software ofrece flexibilidad durante el funcionamiento 2D y 3D.